Nature Comm︱宋建人课题组发现脊髓损伤后促进神经环路重建的新靶点

撰文︱黄春筱，关娜

责编︱王思珍

躯体运动节律和模式的产生依赖于激活位于脊髓腹侧的中央模式产生器（central pattern generator，CPG）[1-3]。大脑瞬时性的运动命令通过脊髓网状神经元的长轴突传递至脊髓运动区域，从而激活脊髓CPG中相应的神经元，驱动机体产生特定的运动行为。脊髓CPG中的兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性甘氨酸能神经元通过特定的联接形成神经环路，决定运动的节律和模式。严重的脊髓损伤不但损毁大脑内下行投射至脊髓的神经元长轴突，导致运动命令的缺失；而且破坏脊髓CPG中的神经环路构成，以至运动行为无法产生。现有研究发现采用基因操纵或者研发新材料，辅助以外源性的特定生长因子或作用于其受体等方法，能促进脑源性长轴突生长和运动功能的部分恢复[4-7]。然而，受限于研究动物模型，脊髓CPG神经环路如何在损伤后重建和是否存在不依赖大脑的脊髓内源性的修复机制目前还不清楚。

五羟色胺对于脊髓CPG的运行至关重要，其缺失会导致脊髓运动神经环路无法正常工作。脊髓内的五羟色胺主要来源于大脑中缝核和脊髓内的五羟色胺能神经元。已有研究发现灵长类、啮齿类和硬骨鱼的脊髓内都存在五羟色胺能神经元。大鼠和斑马鱼等动物脊髓损伤后，外源性的五羟色胺或者中缝核神经元移植可促进脊髓损伤后运动能力的恢复。由于脊髓五羟色胺能神经元数目多和空间分布广，并且其受体亚型分类复杂，因此脊髓损伤后五羟色胺能神经元是否发生变化以及其通过何种受体亚型发挥作用一直是领域内的难点问题。

2021年12月7日，同济大学医学院的宋建人教授课题组在Nature Communications杂志上发表了题为“An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish”的研究论文。同济大学助理研究员黄春筱老师为论文第一作者，同济大学宋建人教授和关娜副教授为论文共同通讯作者。该研究发现脊髓损伤修复后重建的脊髓CPG与正常情况下相比，其兴奋性与抑制性神经元的构成发生了显著变化，并进一步揭示了脊髓内源性的新生五羟色胺能神经元亚群通过持续释放五羟色胺并靶向Htr1b受体，促进脊髓兴奋性中间神经元轴突再生修复的机制，为脊髓损伤的基础研究和治疗提供了新的思路。

为了解答上述科学问题，研究者采用中枢神经系统再生能力较强的成年斑马鱼脊髓损伤模型（图1 a）。利用红色荧光标记Rhodamine Dextran在损伤处尾端进行神经元逆行标记的方式，研究者发现在脊髓完全损伤8周后，被截断的脊髓中间神经元长投射轴突再生穿过损伤处（图1 g-h）。并且，行为学检测发现其躯体运动能力基本恢复（图1 c, d）。肌电记录实验结果表明，动物躯体运动的头尾协调性有效修复（图1 e, f）。利用特意性标记五羟色胺能神经元的转基因斑马鱼系Tg(tph2:GFP)，研究者发现脊髓损伤后，在损伤节段处聚集了一群损伤诱导的新生脊髓内五羟色胺能神经元亚群，它们的数目和脊髓中间神经元轴突再生以及运动能力恢复呈现正相关（图1b，j）。

图1 损伤诱导的ISNs再生与运动恢复正相关

（图源：Huang CX et al., Nat Commun, 2021）

为了验证该群新生五羟色胺能神经元亚型群是否对脊髓损伤后运动能力的恢复有促进作用，研究者采用了化学遗传的技术，在损伤后特异性地消除该群新生五羟色胺能神经元。此亚群神经元缺失导致了脊髓损伤后的运动能力的恢复发生障碍（图2 a-g）。而后研究者创造性的开发出脊髓二切模型，也即利用斑马鱼模型的优势，在第一次脊髓全切1周后，进行下游脊髓节段的二次全切。由于斑马鱼脊髓损伤后，大脑下行的五羟色胺能神经元轴突再生能力有限[8]，二切模型的采用很好的排除了大脑下行支配对脊髓影响，可以用于验证五羟色胺能神经元亚型群的出现和对脊髓损伤后修复的作用是否是脊髓内源性机制。在二切模型上，研究者同样验证了大量损伤诱导的新生五羟色胺能神经元的出现和脊髓神经元轴突的再生（图1 j-l），同时采用化学遗传技术消除二切模型上新生五羟色能神经元后，脊髓运动的恢复明显受阻（图2 b-m）。上述实验结果进一步证明新生五羟色能神经元亚群通过一种脊髓内源调控机制对脊髓损伤后修复和运动能力恢复具有促进作用。

图2 损伤诱导的ISNs对轴突再生和运动恢复至关重要

（图源：Huang CX et al., Nat Commun, 2021）

由于生理状态下五羟色胺能神经元存在明显的分子和细胞水平的分化，研究者进一步探究这群损伤诱导的新生ISNs是否形成一个特殊的功能亚群，以促进和维持损伤修复过程。研究者采用电生理的方法发现，在同一损伤动物脊髓内，与非损伤处的五羟色胺能神经元相比，损伤处五羟色胺能神经元自主发放高频率的动作电位（图3 a-c），同时双光子钙离子成像实验证明其胞体和轴突有很强的钙信号波动（图3 e-h）。这暗示此神经元亚群有可能在损伤处高强度地释放五羟色胺，参与脊髓损伤后神经环路的修复。研究者进一步采用液质联用的技术，验证了损伤处脊髓节段内胞外五羟色胺的浓度是非损伤处脊髓节段内胞外五羟色胺的浓度的3倍（图3 i）。因此，此群新生五羟色胺能神经元亚型聚集在损伤处通过其高度且持续活跃的电活动特征，为损伤处脊髓节段提供高浓度的五羟色胺微环境，促进受损的脊髓神经环路修复和运动功能的恢复。

图3 损伤诱导的ISNs形成特殊的功能亚群通过大量释放五羟色胺促进轴突再生

（图源：Huang CX et al., Nat Commun, 2021）

斑马鱼脊髓全切损伤后，其运动能力可修复，尤其是损伤后动物躯体运动的头尾协调性有效修复（图1 e-f），这表明其脊髓内神经元轴突由头端向尾端的再生长和脊髓神经环路的重建。研究者进一步发现脊髓全切后，切口头端脊髓节段处的兴奋性谷氨酸能神经元的轴突具有更强的再生能力，占所有轴突可再生穿过损伤处神经元的80%以上；与此相比，抑制性的甘氨酸能神经元却只占低于10%（图4 e, f）。正常斑马鱼脊髓中兴奋性谷氨酸能神经元与抑制性的甘氨酸能神经元的比例约为1：1。因此，斑马鱼脊髓损伤修复后，其重建的运动神经环路与正常情况下相比发生了变化，尤其是兴奋性与抑制性神经元的构成。那么锚定再生能力更强的兴奋性神经元的修复机制便成为一个突破口。

通过基因测序手段，研究者发现轴突再生长穿过脊髓损伤处的谷氨酸能神经元上高表达htr1b受体基因（图4 a, b, g, h）。给予脊髓损伤的动物Htr1b受体激动剂可促进神经元的轴突再生和动物运动能力的恢复。采用CRISPR-Cas9的方法敲除斑马鱼体内的htr1b受体基因，在htr1b^-/-脊髓损伤模型上，脊髓内谷氨酸能神经换的轴突再生受到抑制，并且动物运动功能恢复程度低（图4 c-d，i-l）。提示Htr1b受体是一种脊髓内源性五羟色胺参与轴突再生修复机制的作用靶点。

图4 五羟色胺通过靶向5-HT_1B受体促进脊髓兴奋性中间神经元轴突再生

（图源：Huang CX et al., Nat Commun, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究揭示了斑马鱼脊髓损伤后，脊髓中间神经元轴突再生和运动恢复的内源调控机制。研究发现一群损伤诱导的新生脊髓内五羟色胺能神经元亚群聚集在损伤处通过其高度且持续活跃的电活动特征，为损伤处脊髓节段提供高浓度的五羟色胺微环境，促进受损的脊髓神经环路修复和运动功能的恢复。同时，斑马鱼脊髓损伤修复后，其重建的运动神经环路与正常情况下相比发生了变化，尤其是兴奋性与抑制性神经元的构成。那么锚定再生能力更强的兴奋性神经元的修复机制便成为下一个突破口。本研究发现Htr1b受体是一种脊髓内源性五羟色胺参与轴突再生修复机制的作用靶点，小鼠或者人脊髓截断后是否也能发现类似现象，或者该受体靶点的人为干预是否也能达到治疗效果仍需要进一步的研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27419-w

（照片提供自：宋建人实验室）

同济大学助理研究员黄春筱老师为本文第一作者(位置左)，同济大学宋建人教授（位置右）和关娜副教授（位置中）为本文共同通讯作者。本研究得到同济大学医学院章小清教授、中科院神经科学研究所何杰研究员的指导和支持。得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科委重大专项、上海市自然科学基金、同济大学附属上海市第四人民医院、同济大学脑与脊髓临床研究中心、同济大学医学院脑功能与人工智能转化研究所等资助。

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参考文献（上下滑动查看）  

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制版︱王思珍

本文完